蛋白提取方法

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织和细胞的来源：

1.1.2 仪器设备

机械组织匀浆器

低温高速离心机 (>40,000 g)

超速离心机

超生细胞破碎仪

超纯水装置

1.1.3 试剂

三氯醋酸 (TCA)

丙酮

二硫苏糖醇 (DTT)

尿素

CHAPS

PMSF

EDTA

乙醇

磷酸

考马斯亮蓝R350

抑肽素A

亮肽素

试剂纯度均应是分析纯或以上。

1.1.4 溶液配制

(1) PBS：

NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L；

(2) EDTA 储存液：

18.61 g Na2EDTA?2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用；

(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×)

10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存；

(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×)

1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存；

(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×):

17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。

DTT 储存液 (1 M):

0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。

(7) 裂解液:

Lysis buffer A

(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer B

(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer C

40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O

Lysis buffer D

(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)

Lysis buffer E

(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)

Lysis buffer F

100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)

●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。

蛋白酶抑制剂混合物[3]

成分 终浓度

蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM

EDTA 0.3 mg/ml (1 mM)

抑肽素 0.7 μg/ml

亮肽素 0.5 μg/ml

1.2 方法

1.1.1组织蛋白提取方法

1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]

(1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；

(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；

(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；

(4)蛋白–20℃沉淀过夜；

(5)35000×g(6℃)离心30min；

将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中；

(7)-20℃放置1h；

35000×g(6℃)离心30min；

(9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；

(10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）；

(11)15℃,40000×g，离心1hr；

(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。

1.2.1.2超速离心法

(1)取材；

(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s；

(3)组织悬液15℃，10000×g离心10min；

(4)上清液4℃，150000×g超速离心45min；

(5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min；

取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。

1.2.2培养细胞蛋白提取

1.2.2.1循环冻融法

(1)吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；

(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；

(3)500×g，离心5min；

(4)弃上清，PBS洗三次（室温,500×g，5min），

(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中；

执行Biofuge存储程序8，500×g5min离心；

(7)用200μl微量加液器吸出PBS，弃去；

吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入；

(9)执行Biofuge存储程序6，15℃，40000×g，离心1hr(Biofuge)；

(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。

1.2.2.2超声破碎法

(1)取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次；

(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中；

(3)室温，500×g，离心5min；

(4)弃上清，PBS洗3次（室温,500×g，5min）；

(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g离心5min；

吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（3×10s）；

(7)15℃,40000×g，离心1hr(Biofuge)；

上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。

2结果和讨论

蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。

我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度

在众多的`裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时

有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。